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PALEOPATOLOGIA E PALEOGENETICA: UNA SINTESI DEI SEGRETI RACCHIUSI NEL DNA UMANO ANTICO-DOTT.SSA GABRIELLA FONTECCHIO

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“Non è perché le cose sono difficili che non osiamo,

                                                                    ma è perché non osiamo che sono difficili.”

                                                                                 (Lucio Anneo Seneca)

 

Redazione-Affrontare il tema DNA umano antico (da qui in poi abbreviato “anDNA”, dall’ inglese ancient nuclear DNA, DNA nucleare ossia genomico, appartenente a organismi umani dell’antichità), oltre a richiedere anni di esperienza, necessita il porsi alcuni quesiti focali, fra cui: 1) in quale senso vertono gli studi condotti sul anDNA e, pertanto, quale è il fine ultimo di tali indagini? Presentano o meno un risvolto pratico nella medicina moderna? Che significato esse possono assumere? Che genere di interesse possono suscitare? Quali sono le figure professionali coinvolte?  2) In cosa consistono le specifiche caratteristiche del anDNA e le sue differenze rispetto al DNA moderno? 3) E quali sono le indicazioni e i protocolli più adatti circa le metodologie laboratoristiche di tipo genetico e chimico-analitico qualora ci si accosti allo studio del anDNA affinché i risultati possano essere ritenuti “affidabili”, quindi certi e inconfutabili in tale filone di  ricerca?

In questa sede cercheremo di fornire una risposta a tutte le domande poste, nella maniera più breve possibile, ma tuttavia esaustiva, non dispensandoci  dal ritornare sul tema in un successivo articolo.

Iniziamo con il rispondere al primo quesito.

Anzitutto è da premettere che conducendo indagini sui resti umani di interesse archeologico e sul loro patrimonio genetico, trovandoci di fronte a corpi appartenenti a epoche più o meno remote, andiamo a imbatterci in un argomento amplissimo, il quale si configura quale via di accesso a svariate informazioni capaci di apportare importanti risvolti negli ambiti medico, paleobiologico, anatomopatologico e archeologico circa l’ambiente, lo stile di vita e, non da ultimo, le condizioni di salute delle antiche civiltà. Di particolare rilevanza al fine di approcciare i quesiti poc’anzi posti, è la paleogenetica, che si propone quale disciplina avvalentesi, onde conseguire una sua completezza scientifica, di una collaborazione con specifiche figure professionali, inclusi paleopatologi, anatomopatologi, antropologi forensi, archeologi, chimici analitici e genetisti/biologi molecolari. Dette collaborazioni conferiscono,  in tal modo, una connotazione multidisciplinare fondamentale per un corretto e proficuo esame dei resti umani del passato, in particolar modo qualora ci si voglia calare nel contesto ambientale in cui vissero le popolazioni (o anche visse un singolo individuo) oggetto dell’indagine, inserendoci così nel campo della biologia evoluzionistica. In sostanza, è proprio sotto quest’ottica che si pone la ricerca paleogenetica sul anDNA, volta a ricostruire presenza, origine e diffusione (nel tempo e nello spazio) di determinate malattie presenti già nel passato e che trovano riferimenti con patologie moderne; in altre parole, ci riferiamo a malattie ereditarie comparse in differenti epoche storiche, in particolare patologie HLA-linked (Human Leucocyte Antigens: “sistema antigenico leucocitario umano”, preposto sia alla difesa nell’uomo da agenti patogeni sia allo sviluppo e manifestazione di malattie autoimminitarie -aggressive nei confronti dell’uomo- di varia natura), da studiare attraverso il DNA antico, tra l’altro mediante l’applicazione di tecniche di laboratorio che richiamano quelle di tipo forense, ma innovative quanto ai protocolli sperimentali testati. Per l’appunto, come meglio puntualizzato e più ampiamente sviluppato in seguito, l’anDNA è alterato nella sua propria struttura base, danneggiata in virtù  del tempo trascorso dal momento della morte contestualmente alle condizioni sfavorevoli alla sua conservazione, a significare un substrato biologico macromolecolare difficoltoso (l’anDNA), alquanto arduo da manipolare  (al pari dell’interpretare ed elaborare i risultati ottenuti), talora addirittura non rintracciabile, dunque inaccessibile, purtroppo inesplorabile.

Va aggiunto che ai reperti umani antichi può (e deve, ove possibile) applicarsi la  paleopatologia, intesa come quella scienza che studia le vestigia morfologiche delle malattie sviluppatesi in tempi non attuali e che rivolge tale interesse alle malattie del passato (poi giunte all’uomo moderno) attraverso l’esame diretto dei resti, scheletrici o mummificati, che ci sono pervenuti al giorno d’oggi. Verosimilmente, la situazione patologica di determinati popoli antichi rappresenta il riflesso delle loro condizioni generali e di sviluppo, ed è proprio dalla conoscenza dal tipo e dell’incidenza delle diverse malattie manifestatesi in epoche remote che è possibile risalire, in via indiretta, alle loro abitudini e al loro stile di vita. In tal senso, la ricerca dell’epoca d’insorgenza di alcune malattie attuali e il tentativo di ricostruire le prime vie della loro diffusione, soprattutto con riferimento a quelle di natura infettiva (qualora correlabili a note condizioni igieniche in cui viveva un particolare popolo, concetto ripreso più avanti nel testo), suscitano un altissimo interesse nel campo della medicina. Per inciso, la paleopatologia ricorre anche alla storia della medicina, là dove siano disponibili utili e attendibili documentazioni storico-letterarie e/o iconografiche (iconodiagnostica). Di fatto, le due discipline, storia della medicina e paleopatologia, ben si integrano fra loro, contribuendo da un lato a fornire una serie di dati di innegabile importanza dal punto di vista storico, antropologico e culturale, dall’altro a fornire informazioni che spesse volte fungono da input per la ricerca a livello paleogenetico (Fontecchio et al., “Further genomic testing and histological examination confirm the diagnosis of rheumatoid arthritis in an italian mummy from the 16th century; Ann.Rheuym.Dis.,2012).   Inoltre, la paleopatologia costituisce una materia che, grazie a tecnologie avanzate, ha consentito di acquisire conoscenze mediche di applicazione odierna alquanto approfondite. In via di esempio, l’analisi radiografica (come anche una TAC), permette di “sezionare”, in maniera non invasiva, i campioni dei resti a disposizione, definendo così dettagli corporei interni non altrimenti esplorabili, ed è  inoltre in grado di documentare, come oggetto di successiva precisazione, la risposta dell’osso stesso alle sollecitazioni meccaniche fisiologiche, oppure in corso di varie condizioni patologiche (come nel caso dell’osteoporosi, ampiamente documentata in reperti che ne erano afflitti in vita). Per tale motivazione, una indagine paleopatologica condotta di concerto con quella paleogenetica risulta possibile, però, soltanto in determinate condizioni di conservazione del materiale genomico umano (con riferimento al solo DNA nucleare, recante i geni responsabili delle caratteristiche peculiari di ciascun uomo, differente da quello mitocondriale “mtDNA”, a trasmissione unicamente materna e spesso impiegato per ricostruire la storia filogenetica dell’individuo).

Al riguardo, particolari aree territoriali sono di fatto contraddistinte da un insieme di condizioni climatiche (quali temperatura e umidità, ventilazione, varie condizioni di acidità o alcalinità del luogo di sepoltura, anossia, pH del terreno, concentrazione di taluni specifici metalli, radiazioni UV, attività enzimatiche cellulari e microbiche, presenza di taluni sali minerali e di acidi umici e fulvici nel terreno, azione di nucleasi cellulari rilasciate dalle cellule in corso di decomposizione e reazioni chimiche spontanee come ossidazione e depurinazione -perdita di basi- ecc.) potenzialmente favorenti o meno la preservazione dei resti (umani e animali in generale, ma anche vegetali) e, di conseguenza, del materiale genomico.

Ad esempio, l’Uomo di Tollund (vedi figura), risalente al 300-400 a.C., dopo il decesso, avvenuto (in Danimarca)  per strangolamento (si nota ancora la corda avvolta intorno al collo), venne gettato in una palude ove, se le peculiari condizioni di anossia (assenza di ossigeno, tipica delle torbiere di palude che non consentono la sopravvivenza di microrganismi demolitori anossici) avrebbero potuto contribuire a preservare, in vario grado, il suo DNA, ma tuttavia non ne è stata trovata traccia a causa dell’elevata acidità del luogo, tale da “degradare” la doppia elica del DNA (al pari di quanto osservato nell’ Uomo di Lindow -UK- , oltre a numerosi altri esempi di “mummie di palude”) e ciò a dispetto dei lineamenti del volto, dei tratti somatici nell’insieme e degli organi interni che risultano essere ben conservati.

La figura successiva è relativa a un bambino INUIT di quattro anni, datato intorno al 1500 d.C. e rinvenuto in una tomba in Groenlandia (un ex insediamento costiero del Qllakitsoq).  La mummificazione naturale è ascrivibile a essiccazione per sublimazione dell’acqua corporea, fenomeno legato all’ambiente secco e gelido che ne ha accolto il corpo.

Parimenti, l’Uomo di Similaun (qui mostrato, noto con il nome di ÖTZI e datato tra il 3350 e il 3100 a.C), conservato ed esposto nel Museo Archeologico dell’Alto Adige (Bolzano), rappresenta l’emblema dei risultati di studi multidisciplinari cui si accennava: il corpo venne rinvenuto casualmente nel 1991 nel ghiacciaio del monte omonimo in Val Venosta, posto al confine tra l’Alto Adige e l’Austria. In questo caso, il repentino congelamento post-mortem ne ha preservato il DNA consentendo l’analisi filogenetica mediante l’mtDNA,  il quale ha stabilito essere un “ladino”, riferibile attualmente a popolazioni residenti in alcune vallate del Trentino; l’ascia di rame ne conferma l’esistenza nell’età del rame in Europa centrale; gli oggetti che portava con sé ci hanno fornito importanti informazioni inerenti addirittura le “conoscenze farmacologiche” del tempo: fra questi oggetti vi era un fungo denominato poliporo (Piptoporus betulinus) dotato di proprietà antibiotiche, antinfiammatorie e antiemorragiche; infine, esperti nel settore hanno stabilito che ciò che all’apparenza potevano sembrare tatuaggi variamente diffusi sul corpo (come a livello del polso sinistro e dell’incavo del ginocchio destro) in realtà consistevano in  “intagli terapeutici” finalizzati a lenire il dolore, in particolare da usura delle articolazioni,

Di fatto, l’attuale disponibilità di strumentazioni e tecnologie sempre più all’avanguardia hanno permesso, e permetteranno, di realizzare ricerche approfondite in diversi settori, inaugurando filoni di ricerca estremamente originali.  E’ ben noto ai biologi molecolari e genetisti che, ad oggi, seppur minime tracce di DNA possono essere amplificate, e quindi analizzate, mediante metodica PCR (Polymerase Chain Reaction, o reazione polimerasica a catena), la quale consente di duplicare il DNA fino a ottenerne multiple copie a partire da quantitativi in tracce o, addirittura, a partire da una singola copia. È proprio su questa proprietà  che i biologi molecolari confidano nell’analisi del anDNA.

Un approfondimento sul concreto significato della paleogenetica e implicazioni paleopatologiche…

Quando parliamo di analisi genetiche eseguite su resti del passato è d’obbligo porre in evidenza che deve essere preso in considerazione l’effetto di rimescolanza (o “integrazione”) genica, derivante dal contatto tra gruppi etnici differenti, se si vuole tentare di delineare non solo la storia filogenetica, ma anche quella paleopatologica delle popolazioni. Va considerata, infatti, l’esistenza di una vasta gamma di territori che, a livello globale , è stata spesso teatro, nel corso dei secoli, di numerosi eventi bellici, migratori e/o di colonizzazione territoriale che hanno comportato l’avvicendamento di civiltà in una ben precisa area geografica o, più frequentemente, la commistione tra popoli autoctoni e non, entrambi caratterizzati da propri, specifici patterns genici. Pertanto, è verosimile l’affermazione che a seguito di tali avvenimenti si siano verificati fenomeni di scomparsa o comparsa di nuovi alleli (forme differenti del medesimo gene, uno di derivazione paterna, l’altro, situato sul medesimo cromosoma debitamente numerato, ma di origine paterna) e dunque di nuove combinazioni aplotipiche  (l’insieme di alleli materni su un cromosoma, paterni sul cromosoma omologo), vale a dire predisposizione a sviluppare particolari malattie all’interno di popoli stanziali, poi tramandatesi ai tempi odierni. Come dire, in una ben precisa epoca e in una data popolazione locale, la manifestazione di malattie ereditarie sino ad allora assenti può essere stata diretta conseguenza non tanto di possibili eventi di mutazione genica, ma piuttosto dell’introduzione di alleli responsabili di specifiche patologie, contestualmente all’arrivo di altre popolazioni geneticamente (in vario grado) dissimili. È il caso della comparsa, in una specifica area geografica, di nuove varianti geniche di predisposizione alla manifestazione di malattie autoimmuni (quali artrite reumatoide, spondilite anchilosante, diabete di tipo 1, ecc.). D’altro canto è pur vero che la patocenosi di una popolazione, il cui studio prende in esame la distribuzione degli stati patologici in una determinata collettività stabilitasi in un dato ambiente e considerata in un arco temporale relativamente breve, tiene conto anche delle conseguenze di malattie infettive (tubercolosi, tifo, lebbra, ecc.) riconducibili alle gravi carenze igieniche che caratterizzavano varie epoche storiche e responsabili di numerosi decessi, particolarmente in età precoce, un fenomeno che ha comportato una drastica diminuzione della frequenza, nel pool genico di un popolo, di alleli “di suscettibilità” (o “di rischio”) per lo sviluppo di molteplici malattie ereditarie. Una ovvia conseguenza, ampiamente prevedibile, della divulgazione a livello locale, nazionale e internazionale di nuove e avanzate conoscenze biomolecolari, talora imprescindibili da quelle di carattere storico-antropo-archeologico e chimico-analitico (come più ampiamente discusso oltre nel testo) pure rappresentano un valido mezzo per rivalutare l’interesse turistico verso un determinato territorio.

Aggiungiamo che peculiari analisi paleogenetiche dell’anDNA, meglio se eseguite su un’ampia casistica di reperti, offrono svariate applicazioni: a) valutare il numero effettivo di individui rinvenuti all’interno di sepolture multiple, al fine sia di identificare con certezza segmenti scheletrici appartenenti a ciascun individuo in caso di dubbia attribuzione da parte degli antropologi, sì da ricostruirlo nella sua interezza oltre al fatto di svelare eventuali rapporti di parentela tra gli stessi (Zierdt et al., 1996; Hummel et al., 1955); b) contribuire a ricostruire la storia di civiltà che colonizzarono una determinata area geografica in epoche non attuali, anche fondendosi con o subentrando a popolazioni preesistenti (ambito della disciplina di “genetica di popolazione”); c) condurre indagini riguardanti patologie genetiche ereditarie, fra cui in primis quelle di natura autoimmune a insorgenza frequentemente correlata a fattori ambientali scatenanti (agenti infettivi, dieta, intossicazioni da metalli pesanti, e quant’altro): è il caso di numerose malattie reumatologiche o endocrine la cui epoca di comparsa, diffusione spazio-temporale ed etiologia di insorgenza sono tuttora non comprese appieno; d) consentire la determinazione del sesso nel caso di resti ossei appartenenti a individui sub-adulti o infanti, per i quali è incompleto e scarsamente evidente lo sviluppo dei caratteri sessuali (Stone et al., 1996); e) sostenere, rafforzare o confutare diagnosi paleopatologiche formulate a seguito di esami macroscopici e strumentali (ad esempio, esami istologici e diagnostica per immagini: TAC, RMN) dei resti, magari affiancandovi anche tests per l’individuazione di genomi microrganismici responsabili di malattie infettive (Salo et al., 1994) e di varianti geniche associate a malattie a trasmissione ereditaria, ovvero di suscettibilità a manifestarle,  ma anche  f) risolvere casi controversi qualora risultasse arduo diagnosticare una patologia a causa di non adeguate conservazione e integrità tissutale dei reperti antropologici, o anche sussistano dubbie interpretazioni (situazione non infrequente) su una data patologia genetica, i cui segni e sintomi sono riportati in documenti storici.

È, questo, un insieme di informazioni che offrono la potenzialità di garantire una “rilettura” in chiave scientifica dal momento che, nella fattispecie, in epoche passate le conoscenze mediche erano assai limitate rispetto ai giorni odierni. In sintesi, gli studi inerenti la cultura, la storia e l’evoluzione delle popolazioni di qualsivoglia entroterra apparirebbero incompleti se non tenessimo conto dell’origine e della diffusione delle malattie e del ruolo fondamentale che queste hanno svolto nei processi di evoluzione dell’uomo e del suo adattamento all’ambiente nel corso dei secoli.

Introduciamo ora la risposta al secondo quesito.

È da evidenziare che i saggi paleogenetici di scheletri o corpi mummificati umani antichi risultano essere contraddistinti da numerose problematiche che spesso ostacolano estrazione, purificazione e analisi dell’anDNA. Come lettura a scopo introduttivo concernente l’anDNA, si consiglia la consultazione del volume “Il DNA antico” di David Caramelli e Martina Lari (2004), mentre, per un approfondimento più completo e specifico incentrato su tematiche inerenti lesioni dell’anDNA e le loro cause, si può ricorrere all’articolo “Review paper. Ancient DNA Willerslev” (, 2005).

Ribadiamo che gli scopi della ricerca sul anDNA sono molteplici: 1) sfidare il difficoltoso ottenimento del DNA antico, spesso altamente frammentato a causa dell’età dei campioni e dell’intervento di fattori ambientali e antropologici che hanno agito negativamente sul suo stato di conservazione, come  documentato da una copiosa letteratura al riguardo; 2) valutare le sue condizioni (“status”) di conservazione e la reale appartenenza ai soggetti in studio (“autenticità”) mediante il ricorso ad analisi chimico-analitiche cromatografiche di tipo HPLC (Cromatografia liquida ad alta prestazione); come discusso in seguito; 3) supportare gli esami antropo-paleopatologici  in caso di dubbia diagnosi attraverso l’applicazione di metodiche prettamente di natura genetica; 4) contribuire a ristabilire origini, etiopatogenesi e diffusione delle patologie che attualmente colpiscono gran parte della popolazione odierna. Ricordiamo che le patologie cui è affetto adoggi l’uomo sono in gran parte trasmesse dai suoi antenati.

Riassumendo, le analisi paleopatologiche macro- e micro-scopiche, quali la diagnosi strumentale (Raggi X, TAC) e vari screenigs istopatologici, abbisognano di essere affiancati da specifici studi cromatografici effettuabili esclusivamente attraverso la chimica analitica (in particolare la tecnica HPLC: Comatografia Liquida ad alta Pressione/Prestazione; Fontecchio G, Poma A, Carlucci G, “Role of HPLC analysis on paleogenetic and forensic sciences”, Abstract Books, Isola d’Elba 2012) e da numerose tipologie di saggi di tipo genetico, o meglio immunogenetico, (con riferimento a studi inerenti il sistema HLA: Human Leucocyte Antigens), qualora la finalità  consista nell’individuare la presenza o meno di geni predisponenti per una patologia “sospettata”, nel senso di “presunta” sulla base di previo esame istopatologico del campione antropologico o la cui diagnosi risulta addirittura di dubbia interpretazione e oggetto di dibattito. E’ da sottolineare che le analisi HLA non possiedono valore diagnostico, ma vanno a compenetrarsi (da qui la loro necessità di esecuzione) con tutte le altre, già citate, discipline.

 

Cenni sui processi diagenetici dei corpi umani che si instaurano dopo la morte

D’obbligo sono talune considerazioni prima di affrontare studi chimico-analitici e paleogenetici. Il decadimento successivo al decesso di un corpo umano è un processo estremamente complesso; questo inizia con autolisi enzimatica e putrefazione seguita da lenta decomposizione chimica nonché microbica, aerobica ed anaerobica operata da microrganismi specifici, del materiale organico. Tale decadimento spesso conduce alla scheletrizzazione del corpo per demolizione completa dei tessuti molli. Successivamente alla morte, un corpo va incontro a liquefazione all’incirca nell’arco di un mese e, a seguire, scheletrizzazione, qualora si instaurino le condizioni adatte affinché essa si realizzi; in tal caso si completa entro un anno. I microrganismi colonizzatori del corpo, oltre a rilasciare enzimi propri che digeriscono i componenti polimerici organici (inclusi gli acidi nucleici: RNA e DNA) in ulteriori molecole di ridotte dimensioni, rendono conto della contaminazione del DNA endogeno (ossia proprio dell’organismo oggetto di studio) derivanti da genomi esogeni (microrganismi) invasivi. All’azione decompositrice di batteri e funghi (componente esogena) si somma quella degli enzimi endogeni autolitici.

In taluni casi i corpi vanno incontro a mummificazione naturale. Quest’ultima è distinta da quella ottenuta artificialmente ad opera dell’intervento umano, meglio nota come imbalsamazione, una pratica conseguibile mediante essiccazione che spesso permette una conservazione macroscopica più o meno completa dei tessuti, in particolare quello osseo. La disidratazione, infatti, riferibile anche e soprattutto alla mummificazione “naturale”, arresta, in vario grado, la degradazione della morfologia grossolana dei tessuti inibendone gli enzimi, endogeni e/o esogeni, responsabili della degradazione dei suoi costituenti, i quali necessitano di un mezzo acquoso per esercitare la loro attività litica (per “lisi” si intende un processo di rottura delle macromolecole biologiche attraverso l’intervento di molecole di acqua). La mummificazione ha, pertanto, la caratteristica di instaurarsi  in tempi più brevi rispetto alla decomposizione, quest’ultima essendo un processo lento e progressivo. L’anDNA è più facilmente reperibile in tessuti andati incontro a mummificazione naturale.

 

Il tessuto osseo  è considerato il bersaglio più adatto (suitable target) per l’esecuzione di analisi genetiche. Uno sguardo alla diagenesi delle biomolecole.

Come anticipato, le cellule e le strutture subcellulari sono scarsamente conservate nei resti antichi sebbene sussistano, seppur di rado, evidenze di nuclei intatti osservati in mummie del  Vecchio e del Nuovo Mondo. Disponendo di soggetti mummificati, il materiale di scelta per lo studio del anDNA resta sempre l’osso compatto, per il fatto che le lacune osteocitiche si comportano come “nicchie protettive” nei confronti degli acidi nucleici.  E’ proprio da questi “involucri naturali protettivi” che è possibile estrarre l’anDNA, compito ben più difficile se confrontato con quello inerente l’ottenimento del mtDNA. Naturalmente, il ricavare l’anDNA dall’ osso compatto è strettamente correlato alla condizione di preservazione dell’intero organismo. Dati di letteratura dimostrano che la colorazione con ematossilina ha identificato dettagli nucleari in tessuti ottenuti da una mummia egiziana e l’analisi di tessuti mummificati, di origine peruviana, mediante colorazione di Feulgen, ha rivelato che, approssimativamente, una cellula muscolare su 3000 conteneva nuclei intatti; si tratta di evidenze essenziali per effettuare in seguito analisi genetiche. La perdita dei confini compartimentali è generalmente consona con altri processi autolitici iniziati con la necrosi tessutale. Il tessuto osseo compatto rappresenta un materiale di consistenza dura, una forma di collagene mineralizzato. Esso è composto da osteociti e da una sostanza intercellulare costituita da una componente organica e da una componente inorganica. La componente organica è formata da fibre collagene cementate da una sostanza amorfa (osteomucoide) costituita da complessi proteico-mucopolisaccaridici (peptidoglicani) e da glicoproteine. La componente inorganica rappresenta, invece, il 65% del peso secco dell’osso ed è formata principalmente da fosfato di calcio e, in quantità minore, da carbonato di calcio, fluoruro di calcio e fosfato di magnesio (“cristalli di idrossiapatite”).

In generale, le due proteine più abbondanti nell’osso sono il collagene di tipo I (CI) e l’osteocalcina. In particolare, tra le numerose forme di collagene, quello di tipo II (CII) è preponderante nella cartilagine delle articolazioni. Il collagene è una proteina dalla matrice ossea, ripetitiva e insolubile, e la sua abbondanza è del 22% in peso e del 36% in volume di osso compatto. Il collagene nell’osso, diversamente da quanto si verifica nei tessuti molli, è più protetto per esclusione fisica degli enzimi extracellulari microbici, il che favorisce la “sopravvivenza” del collagene stesso. L’osteocalcina è la seconda proteina più rappresentata (1-2% in peso), ha dimensioni ridotte, possiede un’alta affinità per il minerale osseo e si lega al collagene. Come si evince da taluni studi, la stabilizzazione minerale della proteina (stabilità diagenetica), che in soluzione perde la conformazione stabile, si pensa sia responsabile della sua persistenza nell’osso. Una vasta gamma di altre proteine, meno rappresentate, è stata ritrovata in ossa archeologiche, fra cui emoglobina, albumina, e fosfatasi alcalina.

Non che l’osso sia sempre esente da deterioramento. Anzi, sono possibili 3 vie di deterioramento responsabili di alterazioni macro- e microscopiche che minano l’integrità del tessuto osseo: a) deterioramento chimico della materia organica (soprattutto del collagene), b) deterioramento chimico della componente minerale e c) biodegradazione. Ciascuno di questi processi può predominare in differenti ambienti di sepoltura.

Danni al collagene conducono a modificazioni nell’organizzazione del tessuto osseo. La velocità alla quale il collagene viene perso dopo la morte dipende dal tempo intercorso tra il decesso e il rinvenimento del corpo, dalla temperatura, dal pH ambientale, dalla presenza di acidi organici (nel suolo)  e, soprattutto, dalla eventuale preesistenza di una condizione osteoporotica degli individui quando erano ancora in vita. Alte temperature accelerano la perdita del collagene. Anche valori di pH estremi (acidi od alcalini) accelerano l’idrolisi del collagene oltre a quella del DNA. In fossili ben conservati è tipicamente assente la porosità riconducibile a perdita di collagene, presumibilmente per infiltrazione di minerali secondari, sebbene alcune ossa conservino una fisiologica porosità (canalicoli, canali Haversiani e lacune osteocitiche). Tale digressione è essenziale ai fini di una migliore comprensione delle analisi condotte mediante l’HPLC.

Questa via, ovvero la lenta perdita del collagene per idrolisi chimica con riempimento delle conseguenti porosità, è un meccanismo che conduce a fossilizzazione dell’osso. Al contrario, le reazioni definite di glicazione rendono il collagene più friabile. In generale, la degradazione delle proteine è ascrivibile all’azione dei radicali liberi e a processi di glicazione. La glicazione, nota col nome di reazione di Maillard o “glicosilazione non-enzimatica”, è una reazione in cui zuccheri riducenti vengono legati a proteine in assenza dell’intervento di un enzima; l’attacco dello zucchero glucosio avviene ai gruppi amminici liberi dei residui di arginina e lisina non coinvolti nel legame peptidico. Una tipica reazione tra glucosio e lisina nella molecola proteica è illustrata in figura.

Va notato che, in soggetti anziani, con l’età la fragilità dell’osso si accorda con un incremento nella porosità ossea e un declino nella mineralizzazione del collagene.  Tumulazioni in ambienti freschi e ben ventilati (asciutti) volgono a favore di una maggiore conservazione del tessuto osseo. L’idrolisi del collagene correlata a valori di pH estremi (eccessivamente alcalini o acidi) è un aspetto da prendere in considerazione piuttosto nel caso di tumulazioni che prevedano un contatto diretto del corpo col terreno.

Collins et al. riferiscono che, nell’ambiente di sepoltura, valori estremi di pH possano essere mitigati dalla concentrazione minerale, la quale agirebbe pertanto come un tampone. L’osso minerale è in profondo disequilibrio con l’acqua piovana. In ossa stratificate sopra o sotto tavole d’acqua o che giacciano in ambienti eccessivamente umidi, la dissoluzione della componente minerale espone il collagene a una accelerata degradazione chimica e biologica. È estremamente importante in tal senso conoscere le condizioni climatiche e idrogeologiche del sito di ritrovamento. Bassi valori di pH comportano dissoluzione della fase minerale.

Resta il fatto che il deterioramento microbico delle macromolecole è il meccanismo più comune e inizia rapidamente dopo la morte; diversamente da quanto accade per il deterioramento chimico, l’attività microbica è ottimizzata a pH neutro e favorita da temperature elevate. La eventuale rimozione della fase minerale facilita l’attacco del collagene da parte degli enzimi microbici. Al contrario dei processi chimici, infatti, l’azione dei microrganismi sembra localizzata in zone discrete, perlopiù dove si è verificata dissoluzione minerale, fenomeno noto come “distruzione focale microscopica”.  Al di fuori di queste aree, il collagene va comunque incontro a degradazione chimica  governata principalmente da fattori fisici (tempo e temperatura in primo luogo). Dal numero di isole di osso, la cui struttura sembra permanere inalterata, dipende strettamente il successo di ottenere acidi nucleici ben preservati.

Per rispondere al terzo quesito, va innanzitutto preso in considerazione il fatto che età e condizioni dell’osso al momento della morte, tempo intercorso tra morte e sepoltura, pratiche culturali e ambiente di tumulazione, modulano la storia della morte e delineano l’andamento della diagenesi. Va sottolineato che le alterazioni biomolecolari restano un aspetto ancora largamente inesplorato della diagenesi ossea, nonostante sia accertato che, in base alle condizioni ambientali che si instaurano causando deterioramento chimico e microbico, dette alterazioni  possono essere ritardate da alcuni fattori identici a quelli impiegati per preservare le proteine (sotto sale, disseccamento, congelamento e “tanning” (letteralmente: “conciatura”, in senso di imbalsamazione). È da notare che, non di rado, le mummie naturali, soprattutto di individui rimasti esposti e non sepolti (ad es. all’interno di ambienti chiusi o cripte), sono il prodotto di basse temperature, presenza di una adeguata ventilazione (che riduce il tasso di umidità) e scarsa luminosità. Infatti, la morte, dopo i primi tempi, è accompagnata dalla perdita delle attività enzimatiche tra cui i sistemi di riparo del DNA (i così detti “sistemi SOS”): per tale ragione, se l’organismo resta esposto alla luce UV gli acidi nucleici vanno facilmente incontro a frammentazione.

Prima di procedere con l’estrazione del anDNA è assai utile osservare con attenzione l’aspetto esteriore dell’osso; da qui il programmare la modalità di estrazione del anDNA. Ad esempio, in base all’esperienza acquisita lavorando su diverse tipologie di campioni d’osso, come confermato ulteriormente da svariati dati di letteratura, sappiamo che un materiale osseo di consistenza dura e dal colore marrone-grigiastro è molto probabilmente andato incontro a fossilizzazione; viceversa, un osso che si presenti all’osservazione esterna con un elevato grado di porosità e friabile implica danno alla tessitura della struttura ossea stessa; infine, un campione dal colore grigio scuro-nero, tagliato con facilità da un bisturi quasi fosse gomma, è indicativo di una notevole quantità di prodotti di Maillard (accade spesso e in breve tempo, se ad esempio il campione è conservato in frigo di laboratorio con un alto tasso di umidità), quantità talmente elevate che risulta assai difficoltoso l’ottenimento di un anDNA purificato a tal punto da poter essere amplificato.

 

I danni al DNA e implicazioni nell’analisi molecolare: approfondimenti

Numerose sono le possibili modificazioni diagenetiche del anDNA dopo il decesso cosicché, sovente, solo piccole quantità di esso possono essere recuperate dai resti antropologici. Alla morte dell’organismo il DNA inizia subito a degradare, ma con un grado strettamente dipendente dalle condizioni di sepoltura del corpo. L’anDNA va incontro a una serie di processi degradativi che ne alterano la struttura. Queste lesioni sono ascrivibili a molteplici cause (riportate in figura, dove sono posti in risalto i punti del DNA più suscettibili ad attacchi idrolitici,  danni da alchilazione ed ossidativi.) e riassumibili in: modificazione diretta, che ha luogo per azione di enzimi rilasciati da microrganismi e  attività nucleasica cellulare  ad opera di enzimi  eso- ed endo-nucleasici.

Le tipologie di danno cui può andare incontro l’anDNA a seguito di tali cause sono in generale classificabili in due categorie: 1) modificazioni a carico della basi nucleotidiche e/o 2) frammentazione della singola (SSB: single strand breaks) o doppia (DSB : double strand breaks)  elica per effetto dell’idrolisi e coinvolgente un meccanismo diretto (rottura dei legami fosfodiesterici) o indiretto (ossidazione delle basi azotate).

Inoltre, la  depurinazione (taglio ed eliminazione delle basi puriniche) agisce come primo step (passaggio, fase) seguito da rottura dello scheletro zucchero-fosfato per b-eliminazione, che risulta nella rottura idrolitica del anDNA. Pertanto sembra essere la depurinazione il fenomeno base che conduce a destabilizzazione del legame fosfodiestere (legame instaurantesi tra le unità nucleotidiche lungo il filamento del DNA). Recenti ricerche hanno ulteriormente dimostrato che il decadimento del anDNA è per l’appunto riconducibile a rotture del filamento (singole o della doppia elica), perdita di basi, interstrand crosslinks per alchilazione (addizione di un gruppo alchilico), e intermolecular crosslinks per reazione di Maillard, fenomeni che conducono a “miscoding lesions” (misincorporazione di basi durante la PCR); questo tipo di lesioni non consentono una corretta amplificazione del DNA e possono comportare l’amplificazione di tracce di DNA contaminante (estraneo)  e quindi artefatti o falso-positivi.

Nella figura seguente vengono mostrati gli effetti (a i,  a ii) del :“cleavage idrolitico” (idrolisi con rottura del filamento) diretto dello scheletro fosfodiesterico:

 (a) A: depurinazione, risultante in una perdita di base con sito abasico  (sito AP, apurinico) oppure dalla (B,C) rottura del legame glicosidico mediante b-eliminazione. Le rotture (breaks) dei filamenti sono responsabili della ridotta lunghezza dei frammenti  e dell’alto tasso di perdita di DNA nei resti fossili.

(b) Diversi tipi di formazione di crosslinks (legami crociati): (b i) interstrand crosslink (legame crociato intraelica, un legame covalente tra i due filamenti del DNA), mediante alchilazione; ciò comporta assenza di amplificazione PCR e possibilità di contaminazione. Agenti alchilanti hanno in comune la proprietà di divenire potenti elettrofili, in particolare quando si trovano di fronte atomi fortemente nucleofili come l’N (azoto) in posizione 3 della base azotata adenina, ma soprattutto l’N7 della base guanina. Gli interstrand-crosslinks che possono impedire la PCR poiché i due filamenti di DNA non possono separarsi. La modificazione della base per alchilazione può indebolire il legame N-glicosidico e comportare  depurinazione (distacco con perdita delle basi Adenina -A- e Guanina -G-) e/o depirimidinazione (distacco e perdita delle basi Timina -T- e Citosina -C-). L’alchilazione in N7 comporta la redistribuzione delle cariche; come conseguenza l’N9 della G, che si lega allo zucchero di deossiribosio,  viene protonato e si distacca lasciando un “buco AP (vuoto APurinico)”; ciò  può esitare in rotture oppure, durante la PCR, viene introdotta una base a caso con rischio di transizione GC”AT o transversioni GC”TA (mutazioni).

(b ii) intermolecular crosslinks: il legame crociato si verifica tra due eliche di DNA o tra un’elica di DNA e una proteina e avviene quale effetto della reazione di Maillard. In generale, i crosslinks possono impedire l’amplificazione di stampi di molecole endogene, causando il fallimento dell’analisi per “infedeltà” della PCR.

(c) Modificazioni ossidative e idrolitiche delle basi, comportanti (c i) blocco a livello della lesione e (c ii) lesioni miscoding. Alcuni danni ossidativi delle basi possono risultare in blocco dell’enzima DNA polimerasi e promuovere le formazione di sequenze chimeriche attraverso il fenomeno del “jumping PCR” (amplificazione del DNA “con doppio innesco”). Infatti la deaminazione idrolitica della base citosina (e del suo omologo 5-metilcitosina) e dell’adenina a uracile e ipoxantina, rispettivamente, sono causa di miscoding lesions con eventi di transizione CG”TA che determinano l’incorporazione di basi erronee durante l’amplificazione PCR.

 Da un esperimento condotto da Paabo and coll. è emerso che la dimensione molecolare media dei frammenti di DNA si aggira intorno a 100-200 bp (base pairs: coppie di basi, fattore indicativo della lunghezza dei frammenti), pur precisando che una sostanziale quantità di DNA migra nel “range” (intervallo di dimensione dei frammenti di anDNA) compreso tra 40 e 500 bp. L’Autore, dedito allo studio del aDNA da decenni, si è avvalso di 12 campioni (indicati da A ad L)  provenienti da un’ampia varietà di regioni geografiche e appartenenti a differenti epoche, amplificati mediante PCR per valutare la lunghezza del DNA estratto. L’immagine si riferisce alla migrazione su gel di agarosio di anDNA estratti da differenti campioni animali e umani. A ciascuna lettera corrisponde una linea diversa su cui è fatto migrare un differente DNA. A: campione di suino deceduto da 4 anni e proveniente dalla Norvegia; B: frammento di pelle di lupo imbalsamato (Thylacinus cynocephalus), conservato dal 1869 nel Museo Zoologico dell’Università di Zurigo; C: pelle di Mylodon (mammifero estinto) risalente a 13.000 anni fa, originario del Cile; D ed E : differenti campioni di pelle di mummia egiziana (località Sayala) datati tra il il VI e il XIX sec. d.C.; F, G e H: diversi campioni di pelle prelevati da una mummia naturale egiziana di 5000 anni fa, rinvenuta a a Gebelein e conservata nel British Museum (Egitto); I: tessuto di colon della mummia Egiziana del 1200 a.C. conservata nel Royal Ontario Museum, Toronto; J: frammenti di organi rinvenuti nella cavità toracica di una mummia egiziana del III sec a.C. forniti dall’Università di Munich (Monaco, Germania); L: testa umana di mummia del Perù risalente al IV-V sec. d.C., conservata nell’Università di Munich; L: tessuto epatico di mummia egiziana del XX-XIX sec. a.C. conservata nel Manchester Museum, UK.

Nei vari campioni di anDNA, Smith et al. hanno osservato una buona correlazione tra il successo dell’amplificazione del DNA ed età del campione, sempre considerando la storia delle condizioni climatiche del sito di ritrovamento. L’ossidazione del anDNA risulta in una più o meno estesa modificazione delle basi.

Cenni sui metodi di estrazione del anDNA

Per quanto concerne le implicazioni dei fenomeni diagenetici sull’esito delle indagini molecolari, precisiamo che i comuni metodi di estrazione e purificazione del anDNA adottati routinariamente nella ricerca possono addirittura inficiare l’ottenimento e la resa di sequenze amplificabili, andando a esacerbare i danni naturalmente prodottisi. Va sottolineato che di protocolli ne esistono in gran quantità, dato che ciascun osso antico possiede proprie caratteristiche.  Inoltre, ribadiamo il concetto che, molto spesso, la manipolazione del campione da parte di numerosi operatori (archeologi, antropologi, paleopatologi), determina inquinamento del anDNA.  soprattutto in mancanza della previsione di una indagine di natura molecolare. In linea generale, il tessuto osseo, da cui è stato previamente rimosso uno strato superficiale di circa 3 mm (finalizzate a eliminare probabili contaminazioni esterne da DNA moderno) mediante strumento Dremel, viene polverizzato meccanicamente sia con il medesimo strumento sia ricorrendo a mortaio e pestello. La polvere di osso contenente il DNA viene quindi trattata con apposite soluzioni tampone arricchite con  EDTA (acido etilandiamminotetracetico), reagente impiegato solitamente per la rimozione del calcio onde facilitarne e completarne la disgregazione; il tutto viene debitamente purificato sia utilizzando agenti emulsionanti idonei a rimuovere i componenti lipidici sia con proteasi per digerire le proteine. Dopo una prima centrifugazione, la frazione surnatante è solitamente estratta con fenolo-cloroformio (ma anche con preparazioni a base di isopropanolo) per eliminare proteine, inquinanti indesiderati. (tra cui i reattivi di Maillard) e altri componenti idrofobici che potrebbero inibire l’amplificazione PCR; in tal modo la fase idrofila contenente il DNA viene ulteriormente purificata e recuperata. Una preparazione relativamente purificata, ricorrendo a svariate metodiche, di acidi nucleici viene precipitata con alcool (etanolo) e il DNA raccolto dissolvendolo in apposito tampone.

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Digressione inerente le analisi sul anDNA condotte a livello chimico-analitico e loro significato. Nello specifico: “Valutazione del grado di integrità e autenticità del  anDNA mediante metodica RP-HPLC con rivelazione in fluorescenza (FL) condotta su enantiomeri aminoacidici da osso intero.”

Come precedentemente accennato,  un importante limite all’analisi genomica è dato dallo stato di conservazione del anDNA estratto dai reperti umani appartenenti a epoche del passato, essendo spesse volte eccessivamente frammentato

Risulta, pertanto, d’obbligo adottare una strategia che informi sulla presenza o assenza di DNA endogeno nel campione da esaminare, come anche sulla sue condizioni di autenticità (intesa come assenza di contaminazione da parte di DNA esogeno moderno) ancor prima di affrontare le numerose e onerose fasi proprie dell’analisi genetica. Un valido supporto proviene dallo studio della racemizzazione degli aminoacidi. Pressoché tutti gli aminoacidi esistono sotto forma di due isomeri ottici, meglio denominati in chimica come enantiomeri, ossia di tipo L e D. In natura, le proteine contengono solo L-aminoacidi. Negli organismi viventi, i tessuti metabolicamente attivi contengono enzimi specializzati, definiti racemasi, che garantiscono un disequilibrio a favore degli enantiomeri  L. Con la morte dell’individuo, tali enzimi cessano di funzionare e gli aminoacidi vanno incontro a racemizzazione, ossia un fenomeno che si instaura lentamente e spontaneamente dopo la morte e consistente nell’interconversione degli aminoacidi dalla forma L alla forma D, (accompagnata da idrolisi: demolizione delle proteine con rilascio di aminoacidi liberi). In queste condizioni, la forma L è libera di interconvertirsi (racemizzazione) in forma D e il rapporto D/L tende a raggiungere  una condizione di equilibrio pari a 1  (50% di isomeri D e 50% di isomeri L). Diversi sono i fattori che influenzano il tasso di racemizzazione, come la struttura e la sequenza aminoacidica, il pH, gli effetti di tamponi e cationi metallici, la presenza di acqua e la temperatura ambientale. E’ stato osservato che la velocità di racemizzazione  dipende dalle medesime variabili che favoriscono la depurinazione del DNA (principale effetto responsabile dell’idrolisi dello stesso e, dunque, della degradazione degli acidi nucleici). Inoltre, il tasso di racemizzazione differisce per ciascun aminoacido. In particolare, l’interesse è rivolto all’acido aspartico (abbreviato: Asp), uno dei più abbondanti aminoacidi contenuti nel tessuto osseo, la cui velocità di racemizzazione è, contrariamente agli altri aminoacidi,   pressoché identica a quella di depurinazione del anDNA, e ciò in condizioni di un ampio “range” di temperatura a pH fisiologico. Alcuni studi in merito (Paabo et al.) suggeriscono che un rapporto D/L Asp  maggiore di 0.1 precluderebbe la possibilità di rinvenire sequenze di DNA sufficientemente lunghe e non danneggiate da risultare amplificabili mediante PCR. In tal senso, la determinazione del rapporto D/L Asp fornisce un valido criterio per stabilire a priori l’integrità del materiale genetico. L’ulteriore valutazione degli enantiomeri di un altro aminoacido definito Alanina (abbreviato: Ala) costituisce altresì un mezzo per porre il sospetto di contaminazione da parte di DNA esogeno. Il motivo consiste nel fatto che la racemizzazione di Asp è più rapida rispetto a quella di altri aminoacidi quali Ala e Leucina (abbreviato: Leu), per cui il rapporto enantiomerico DAsp/LAsp dovrebbe risultare maggiore dei menzionati aminoacidi appartenenti al medesimo corpo e dunque risalenti alla stessa epoca del decesso. Ne deriva che una ratio enantiometica D/L Asp inferiore a quella D/L Ala risulta essere indicativa della presenza di aminoacidi provenienti da epoche più recenti rispetto al campione, indicando la non attendibilità dei risultati. Ad oggi, tra i metodi adottati per accertare l’integrità, nonché l’autenticità del anDNA, si annoverano: analisi in GC (gascromatografia) e in HPLC in fase chirale. Tuttavia, ciascuno dei predetti metodi di analisi della racemizzazione presentano alcuni svantaggi: 1) la GC richiede tempi troppo lunghi e una procedura più elaborata; 2) le colonne con fase stazionaria di tipo chirale sono alquanto più costose di quelle che invece ricorrono a  impaccamenti in fase inversa come l’ottadecilsilano (ODS o C18);  3) di recente, è stata ideata e massa a punto una tecnica innovativa, valida, e soprattutto più rapida ed economica delle precedenti, la quale ha offerto un supporto attendibile nel campo dell’analisi del anDNA, come

dimostrato dal successo dei risultati conseguiti

(Iuliani P.,Di Federico L., Fontecchio G., Carlucci G; J. Sep. Sci., 2010, “RP-HPLC method with fluorescence detection for amino acids D/L ratio determination in fossil bones as a marker of DNA preservation”).

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