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VETTORI MOLECOLARI E TERAPIA GENICA: STRATEGIE E STATO DELL’ARTE-DOTT.SSA GABRIELLA FONTECCHIO BIOLOGO MOLECOLARE

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1) INTRODUZIONE

Redazione-L’attenzione verso la terapia genica è dettata dalla possibilità di utilizzare vettori (virus resi innocui, batterici, cromosomi artificiali, ecc.) che, somministrati a pazienti, risultino adatti a correggere difetti genetici correlati a mutazioni note, più o meno estese e, in particolar modo, causa di malattie ereditarie rare; per citarne alcune, trattate più a fondo in seguito: a) amaurosi congenita di Leber, la più frequente causa di cecità infantile ereditaria (A.M. Maguire et al., “Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber’s congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial”,  The Lancet, 2009);  b) la ADA-SCID, una fra le più comuni manifestazioni di immunodeficienza severa combinata da deficit di adenosina deaminasi (M. Cavazzana-Calvo et al., “Gene therapy for severe combined immunodeficiency: are we there yet?”, J. Clin. Invest., 2007), caratterizzata da compromissione della funzione dei linfociti T, B e cellule NK (natural killer) e comportante spesso morte, entro i primi mesi dalla nascita, imputabile a infezioni da patogeni opportunisti.

I risultati ad oggi conseguiti, seppur preceduti in passato da numerosi ostacoli e insuccessi,  incoraggiano la ricerca nel campo della terapia genica da applicarsi anche a patologie più comuni,  di tipo reumatologico (artrite reumatoide)  e non (Alzheimer, morbo di Parkinson, tumori, infarto).

Parleremo di “vettori”, pertanto è d’obbligo specificare  che per vettore si intende, nel senso generale del termine, un sistema capace di veicolare materiale genetico esogeno (transgene o costrutto) all’interno del DNA delle cellule bersaglio (target). Per “costrutto” si intende un prodotto genico artificiale ottenuto mediante la tecnologia del DNA ricombinante, quindi si può
considerare costrutto un vettore di espressione (impiegato in ingegneria animale o cellulare) o un vettore di clonaggio (utilizzato per ottenere più copie di DNA: amplificazione). In altre parole, un “vettore di espressione” in terapia genica consiste, in fondo, in un sistema progettato in modo tale che un gene terapeutico sano (inserto) venga, una volta somministrato, incorporato nel DNA dell’organismo ospite affetto dalla patologia in esame, dove va a sostituirne la copia mutata, mimandone la funzione.  Gli usi del clonaggio genico sono molteplici e rivelatisi alquanto utili anche nell’ambito del Progetto Genoma Umano; essi possono, inoltre, essere sfruttati in bio-farmaceutica per la sintesi di proteine, ovvero per creare librerie genomiche. Infatti, con riferimento alla modalità che consente il clonaggio di un gene, dopo aver individuato e ben definito un vettore di clonaggio in cui amplificare la sequenza genica bersaglio, si può procedere alla costruzione di una genoteca.  Quest’ultima è costituita da una serie di cloni ricombinanti in modo da contenere tutto il DNA presente in un organismo, ovvero rappresentarne il genoma, magari mediante overlapping (sovrapposizione) delle sequenze clonate, pertanto altro non è che una collezione di geni o frammenti genici ciascuno clonabile in un vettore. Si parla di “trasformazione” quando il DNA esogeno di qualsiasi provenienza viene introdotto in una cellula ospite batterica o di “trasfezione” se inserito in cellule eucariotiche. La maggior parte degli approcci in terapia genica, per l’appunto proposti per affrontare malattie ereditarie o neoplasie, prevede strategie di tipo sostitutivo o additivo in cui la sequenza di DNA contenente il difetto viene sostituita con una corrispondente copia corretta del gene (strategia sostitutiva) o in cui la stessa viene inserita nelle cellule bersaglio senza però rimuovere la sequenza difettiva (strategia additiva). In aggiunta, i protocolli di terapia genica prevedono essenzialmente due approcci, il primo di tipo “ex vivo”, in cui le cellule bersaglio sono prelevate dal paziente, coltivate per effettuare la trasfezione in laboratorio e successivamente reintrodotte nell’organismo, il secondo di tipo “in vivo”, in cui il vettore recante il gene di interesse viene somministrato direttamente nelle cellule bersaglio del soggetto affetto. I vettori attualmente utilizzati in terapia genica si possono suddividere in due grandi categorie: vettori virali e vettori non virali.

 

2) STRATEGIA DI CLONAGGIO E VETTORI NON VIRALI (cenni)

Clonare o analizzare la funzione di un gene richiede una procedura complessa che può essere schematizzata in 3 tappe o step:

  • La prima tappa consiste nella scelta del materiale genetico da usarsi per il clonaggio: è necessario scegliere organismo e condizioni sperimentali di partenza.
  • Il secondo step consiste nella formazione del costrutto contenente il DNA ricombinante. Per ottenere i costrutti si ricorre alla tecnologia del DNA ricombinante che, una volta identificato il gene da isolare e trasferire da una cellula ad un’altra, ne prevede l’isolamento mediante taglio con “enzimi di restrizione”, legame del gene ad un vettore per mezzo di enzimi definiti “ligasi” e trasferimento della sequenza isolata nella cellula ricevente.
  • Il terzo step, probabilmente il più difficoltoso, concerne lo screening dei cloni ricombinanti, vale a dire la loro individuazione all’interno della sequenza di DNA.

La tecnologia del DNA ricombinante si rivela di grande utilità se pensiamo ai numerosi vantaggi che essa offre, più dettagliatamente descritti nel paragrafo 3.

L’organismo d’eccellenza impiegato per le tecniche di clonaggio, particolarmente nel campo dell’ingegneria genetica, ma non certamente l’unico,  è Escherichia coli in quanto facile da coltivare e si duplica rapidamente (ca. ogni 20 minuti).

Tuttavia, come già accennato in precedenza, i vettori di clonaggio più comunemente utilizzati per amplificare geni possono essere virali e non virali, ossia plasmidi, cosmidi e cromosomi artificiali. I plasmidi sono molecole circolari extracromosomali di DNA a doppio filamento che si replicano autonomamente e sono molto diffusi tra i procarioti (batteri). I plasmidi sono caratterizzati da sequenze e regioni specifiche; infatti, sono dotati di una sequenza ori (origine di replicazione che permette al plasmide di replicarsi nelle cellule batteriche), di un marcatore selettivo che solitamente consiste in un gene che conferisce la resistenza del batterio ad un antibiotico (tetraciclina, ampicillina, ecc.,  il che vuol significare che in presenza di un antibiotico le cellula batterica contenente plasmidi resistenti si moltiplicheranno, laddove quelle contenenti plasmidi, privi di resistenza, andranno incontro a morte) e siti unici di taglio per gli enzimi di restrizione.

Sebbene anche i cosmidi rappresentino vettori di clonaggio, a differenza dei plasmidi sono strutture ibride ottenute unendo alla parte plasmidica le estremità di un fago (o batteriofagi, virus che infettano le cellule batteriche) denominate cos (da cui il nome) e in cui possono essere incorporati inserti di maggiori dimensioni rispetto ai plasmidi.

I cromosomi artificiali includono i BAC (Bacterial Artificial Chromosome, di batteri), gli YAC (Yeast Artificial Chromosome, di lievito) e i MAC, (Mammalian Artificial Chromosome, di mammifero) e gli HAC (Human Artificial Chromosome, umani). Le caratteristiche e le applicazioni dei cromosomi artificiali di mammifero verranno brevemente trattate più avanti nel testo.

A causa della estrema complessità dell’argomento affrontato, il presente articolo si focalizzerà sui taluni aspetti e progressi della terapia genica basata su taluni vettori virali e, fra i non virali, i cromosomi artificiali di mammifero e umani.

Un aspetto essenziale da evidenziare per le sue ricadute applicative nel processo di clonaggio o di espressione di geni eterologhi riguarda le dimensioni dei frammenti di DNA che si possono inserire nei vari vettori: infatti, attraverso i plasmidi si possono clonare frammenti di DNA relativamente piccoli che vanno da poche centinaia di paia di basi (bp) fino ad alcune migliaia di bp (8-10 Kbp : kilobasi), mentre la capacità massima degli inserti nei cosmidi è pari a 45 Kbp; al contrario la lunghezza dell’inserto raggiunge 300 Kbp nei BAC,  1000 Kbp (1 Mbp) negli YAC  ed è maggiore di 1Mb per MAC e HAC.

3) VANTAGGI DEI VETTORI DI ESPRESSIONE / CROMOSOMI ARTIFICIALI

In sintesi, attualmente le applicazioni più promettenti dei vettori di clonaggio si hanno in campo sia biomedico sia agroalimentare (organismi OGM, geneticamente modificati).

 Applicazioni biomediche:

  • Sintesi di molecole (microrganismi in grado di sintetizzare farmaci, ormoni, vaccini, enzimi, antibiotici, ecc.);
  • Terapia genica (sostituzione di geni alterati, introduzione di geni in cellule malate allo scopo di “correggerne” il malfunzionamento, introduzione di geni in cellule tumorali che ne inducano la morte, ecc.)

Applicazioni agroalimentari

  • piante resistenti a erbicidi, parassiti, siccità;
  • maggior tempo di conservazione dei prodotti ortofrutticoli e delle sementi;
  • alimenti arricchiti dal punto di vista nutrizionale (vitamina A nel riso, acidi grassi nella soia, ecc.)

Ulteriori applicazioni riguardano prettamente la ricerca biomolecolare finalizzata a facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica e a identificare molecole che vadano a interagire con particolari sequenze genomiche o domini proteici.

In sintesi, le applicazioni in biologia molecolare dei differenti vettori molecolari risultano strettamente dipendenti dalle dimensioni dell’inserto impiegato, pertanto si ricorre ai plasmidi per clonaggio e saggi di espressione genica, mentre per l’analisi di grandi genomi, modelli animali transgenici (ad es. topi) e biotecnologie animali/terapia genica si impiegheranno piuttosto vettori BAC, YAC e vettori virali/cromosomi artificiali di mammifero, rispettivamente.

Certamente sussistono dei vantaggi associati all’impiego di sistemi di vettori basati su cromosomi artificiali rispetto ai vettori convenzionali, due in particolare: a) Il DNA trasferito può essere stabilmente mantenuto senza rischio di integrazione nel genoma dell’ospite che spesso si accompagna a mutagenesi inserzionale o silenziamento del transgene e b) possono essere introdotti lunghi segmenti di DNA che non comprendono unicamente il gene, ma anche i suoi elementi regolatori, permettendo in tal modo di ottenere una espressione transgenica più affidabile. Vettori di espressione in grado di ospitare lunghi frammenti di DNA esogeno sono risultati particolarmente utili in indagini come il Progetto Genoma Umano in quanto ideali per mappare, clonare e sequenziare grandi genomi eucariotici.

L’obiettivo precipuo e finale che si pone la terapia genica è quello di fornire una correzione permanente dei difetti genetici. Per conseguire tale scopo, è necessario che i geni terapeutici siano portati da vettori efficaci, nel senso che siano in grado di fornire i geni “corretti” alle cellule portatrici della copia mutata, contestualmente al “sostenere” la loro espressione con modalità fisiologicamente ben regolate. Tali vettori di gene delivery (letteralmente “liberazione”, “recapito”) devono essere provvisti di ulteriori proprietà consistenti in alta efficienza di trasfezione, livelli appropriati di espressione spaziale e temporale nelle cellule bersaglio e, non da ultimo, assenza di rischio di trasformazione cellulare o stimolazione del sistema immunitario dell’ospite.

4) LIMITI DEI VETTORI CONVENZIONALI E IL VETTORE IDEALE IN TERAPIA GENICA

Un gran numero di differenti approcci sono stati affrontati onde ottenere un efficiente trasferimento genico accompagnato da una espressione a lungo termine del transgene, ma i metodi che utilizzano i vettori virali presentano numerosi limiti. La potenziale utilità dei vettori virali nel campo della terapia genica risiede nell’osservazione che gran parte dei virus (parassiti obbligati) hanno sviluppato, nel corso dell’evoluzione, meccanismi specifici per trasferire in modo efficiente il proprio genoma all’interno delle cellule ospiti quali l’interazione con le cellule tramite legame ad uno o più recettori di membrana e la presenza nel genoma di alcuni virus di sequenze che inducono l’integrazione nel genoma cellulare. Nella produzione di vettori virali si pone, ovviamente, l’attenzione alla eliminazione delle “porzioni” virali responsabili dell’azione patogena e della replicazione del virus, come anche alle relazioni con l’ospite, con particolare riferimento a indesiderate reazioni immunitarie.

Un vettore retrovirale viene ottenuto da un retrovirus naturale reso difettivo per le funzioni non desiderate quali, per l’appunto, la capacità di autoreplicarsi; il vantaggio maggiore di tale sistema risiede nella capacità del vettore di integrarsi nel genoma della cellula ospite assicurando, in tal modo, l’inserzione del gene terapeutico. Si procede al prelievo delle cellule, recanti la mutazione, queste vengono quindi infettate con particelle contenenti il vettore retrovirale e successivamente reimpiantate. D’altro canto, affinché questa tipologia di vettore possa integrarsi nel genoma delle cellule dell’ospite è necessario che queste si trovino in fase di attiva replicazione, in quanto i cromosomi sono raggiunti esclusivamente quando la membrana nucleare si dissolve, un evento che, per l’appunto, si verifica soltanto durante la divisione cellulare. Questa situazione rappresenta però una delle principali limitazioni all’utilizzo dei vettori retrovirali, poiché non li rende idonei a correggere difetti genetici in linee cellulari già terminalmente differenziate o in fase di quiescenza (es: neuroni, cellule muscolari). Un’altra limitazione è data dalla integrazione casuale del vettore all’interno del genoma dell’ospite che potrebbe risultare non solo in un effetto di  mutagenesi inserzionale, anche nella inattivazione del gene terapeutico dovuta a “effetto di posizione”. Il silenziamento trascrizionale causato dalla integrazione di vettori retrovirali è stato spesso dimostrato in cellule staminali di topo e in cellule emopoietiche trasfettate. I vettori retrovirali più comunemente utilizzati derivano principalmente dall’oncoretrovirus della leucemia murina di Moloney (MoLV).

I vettori adenoassociati  vengono attualmente impiegati per tentare di affrontare differenti patologie, di cui verrà riportato quale esempio l’artrite reumatoide, una poliartrite infiammatoria cronica di natura autoimmune, caratterizzata da sinovite erosiva con coinvolgimento delle articolazioni, in particolare quelle degli arti con caratteristiche deformità a carico delle mani e dei piedi (sublussazione e flessione ulnare, iperestensione delle articolazioni interfalangee prossimali, deformazione  “a Z” del pollice e “a collo di cigno” più frequente nel terzo dito della mano, deviazione fibulare dorsale con valgismo delle dita dei piedi, deformazione “a martello dell’alluce” rappresentano i segni più evidenti e caratterizzanti degli stadi iniziali della malattia, che in seguito evolve andando a interessare spalla, gomito e ginocchia fino ad anchilosi per fusione ossea).

Questo sistema,si avvale del vettore rAAV (recombinant Adeno-Associated Virus: virus ricombinante adeno-associato) che, munito di elevata infettività e ridotta immunogenicità, si propone come efficace alternativa ai vettori retrovirali, poiché, oltre ad essere applicabile “ex vivo” lo è anche “in vivo” (inoculabile per via intra-articolare), ovviando al problema del prelievo delle cellule dal paziente e il loro successivo reimpianto (M.C. Boisier, “Therapeutic gene transfer for rheumatoid arthritis, Reumatismo, 2004).

Il medesimo sistema rAAV, d’altro canto, si è dimostrato in altri casi inefficace, come riportato per il trattamento della fibrosi cistica, una malattia ereditaria autosomica recessiva che si manifesta in soggetti omozigoti per il gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) localizzato sul braccio lungo del cromosoma 7 umano e deputato alla regolazione della quantità di cloro secreto con i liquidi biologici; la conseguenza più invalidante è l’eccessiva quantità di denso muco a livello polmonare che può causare problemi respiratori e infezioni. Le cause di detta inefficacia sembrano imputabili ad una inconsistente traduzione del mRNA del gene, insieme a una marcata risposta immunitaria al vettore (W.B. Guggino, “Adeno-associated virus (AAV gene therapy for cystic fibrosis: current barriers and recent developments, Expert. Opin. Biol. Ther., 2017). Gli stessi rAAV non sono risultati parimenti efficaci in casi di emofilia, constatandosi un effetto a breve termine, probabilmente imputabile a una risposta immunitaria nei confronti del vettore (K.A. High, “rAAV human trial experience” Methods Mol. Bio., 2011).

E’ pur vero che a favore dell’efficacia clinica dei rAAV vertono sia  trials clinici condotti fin dalla metà degli anni ’90 su oltre 300 soggetti affetti da artrite reumatoide (somministrazione locale o sistemica) sia studi effettuati su pazienti colpiti da amaurosi congenita di Leber, un disordine ereditario retinico degenerativo: indubbio fu il miglioramento e la stabilità della capacità visiva dopo trattamento con rAAV mediante iniezione intravitreale, per un periodo di 2 anni, in 12 pazienti di età compresa fra 8 e 44 anni.  In letteratura sono altresì riportati miglioramenti clinici e di imaging in soggetti parkinsoniani dopo trasferimento genico nel sistema nervoso centrale. I progressi in terapia genica in termini di un incremento di efficacia e sicurezza dei vettori approntati possono offrire  promettenti prospettive, come è accaduto per la cura dell’ADA-SCID o SCID da carenza di adenosina deaminasi (ADA), un enzima il cui deficit comporta grave linfopenia con morte anche entro il primo anno di vita in assenza di un donatore compatibile o, almeno, aploidentico. Utilizzando HSCs (Hematopoietic Stem Cells: cellule staminali ematopoietiche) autologhe ingegnerizzate con vettori rAAV contenenti il cDNA (DNA complementare) dell’enzima ADA  in modo da ripristinarne la funzione, nel 2016  la Commissione Europea ha autorizzato la GlaxoSmithKline (GSK) alla commercializzazione del prodotto Strimvelis, la prima terapia genica per la cura dell’ADA-SCID, terapia che verrà ricevuta presso l’IRCCS Ospedale San Raffaele di Milano.

Con i vettori adenovirali è possibile infettare cellule non in fase replicativa e permangono in forma episomale (non si integrano nel cromosoma dell’ospite), senza incorrere in rischi di mutagenesi inserzionale. Ai vantaggi sopraccitati si contrappone una serie di svantaggi, tra cui: a) la condizione episomale è fonte di instabilità con conseguente perdita, dopo un certo tempo, del vettore e del gene terapeutico in esso inserito; b) è stato dimostrato che l’espressione delle proteine virali è potenzialmente in grado di indurre una forte risposta immunitaria che conduce all’eliminazione delle cellule infettate e diminuzione dell’espressione del gene nel tempo; c) esiste un limite alla grandezza del frammento di DNA che può essere inserito in un adenovirus (circa 7.5 Kbp);  d) è richiesta  una somministrazione ad alto titolo. Pertanto la tossicità e le risposte immunologiche indesiderate suggeriscono una certa cautela nell’attuare una terapia genica basata su vettori adenovirali.. Noto è il caso, risalente al 1999, di un giovane paziente affetto da una malattia genetica rara definita deficit da OTC (ornithine transcarbamylase: ornitina transcarbamilasi, un enzima che interviene nel ciclo dell’urea) che determina iperammoniemia, una condizione estremamente tossica particolarmente per il sistema nervoso centrale. Dopo aver ricevuto un vettore adenovirale costruito per trasferire il gene per l’OTC il paziente in oggetto andrò incontro ad una forte risposta infiammatoria sistemica con perdita graduale della funzione di numerosi organi che lo condusse al decesso.

Un vantaggio offerto dai Lentivirus (tra cui il virus dell’immunodeficienza acquisita, HIV di tipo 1) consiste nel fatto che possono replicarsi in cellule quiescenti (non replicanti) dal momento che, tra l’altro, espongono sulla loro superficie dei segnali molecolari di migrazione nucleare; questi segnali simulano quelli presenti nei normali costituenti cellulari destinati al nucleo e vengono riconosciuti dal sistema di trasporto attivo a livello dei pori nucleari. E’ stato dimostrato che i vettori basati sul lentivirus del HIV possono mediare un efficiente trasferimento genico “in vivo” e una espressione a lungo termine del transgene in particolare nel sistema nervoso centrale; al contrario non sembrano essere adatti per il trasferimento genico, sempre “ in vivo”, nel fegato e nel muscolo, un aspetto che comporta una notevole limitazione al loro impiego. Altre limitazioni sono correlate alla possibilità di introdursi in geni essenziali, inibendone l’espressione, come pure favorire la trasformazione tumorale inserendosi in geni oncosoppressori (inattivandoli) o in protoncogeni (attivandoli). Per approfondimenti di interesse per gli “addetti ai lavori”, si consiglia la lettura della review pubblicata da D. Escors eK. Breckpot “Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential”, Arch. Immunol. Ther . Exp., 2010.

5) CROMOSOMI ARTIFICIALI  MAC, HAC

Risposte immunitarie contro vettori virali, batteriofagi,  limitazioni legate alle dimensioni dell’inserto di DNA in plasmidi e cosmidi o espressione a breve termine dei transgeni hanno indotto le ricerche ad indirizzarsi di recente verso cromosomi artificiali di mammifero e umane nel campo della terapia genica, cercando di risolvere patologie senza incorrere in rischi per la salute umana, cio’ mediante  la costruzione e l’introduzione nell’ospite di “minicromosomi” MAC. I MAC sono infatti delle molecole di DNA derivate dai cromosomi naturali, che mantengono le caratteristiche funzionali dei cromosomi stessi, ma che agiscono come costrutti portatori del gene corretto. Queste caratteristiche sono conferite dalla presenza di tre elementi fondamentali comuni a tutti i cromosomi naturali: una o più origini di replicazione, una sequenza centromerica che ne garantisca la corretta segregazione durante la divisione mitotica, e i telomeri, localizzati ad entrambe le estremità di ciascun cromosoma e deputati a svolgere tre funzioni principali: a) proteggono le estremità cromosomiche da eventi di ricombinazione; b) sono coinvolti nell’organizzazione dei cromosomi nel nucleo, nell’appaiamento e nella segregazione di questi durante la mitosi e la meiosi; c) permettono la completa replicazione delle estremità dei cromosomi, in modo che non vi sia perdita di materiale genetico. In merito al centromero (una complessa struttura, che generalmente appare come la costrizione primaria di ciascun cromosoma eucariotico in metafase), lo studio del comportamento e dell’attività delle numerose proteine che si complessano con il DNA centromerico assume un ruolo centrale per comprendere quali di esse siano ritenute essenziali nella costruzione e trasformazione delle cellule di mammifero/umane per una corretta segregazione tra cellule figlie, senza incorrere nella perdita del gene terapeutico. Nel senso più ampio, i centromeri pongono significativi problemi per la costruzione di MAC per due ragioni: a) le sequenze di DNA richieste per la funzione centromerica sono scarsamente definite e b) alcune sequenze studiate e capaci di conferire una funzionalità centromerica sono difficili da manipolare.

Resta il fatto che i sistemi MAC e HAC  si replicano e segregano come fossero cromosomi naturali e introdurre MAC/HAC in cellule eucariotiche come ospiti di vettori di espressione è operazione (rispetto ai vettori convenzionali) alquanto facilitata in virtù del fatto che queste sono già dotate dei complessi macchinari di trascrizione, di  modificazione del mRNA e di processamento post‑traduzionale coinvolti nella normale sintesi di un prodotto genico. Questi sistemi non devono, quindi, essere introdotti nel vettore come avviene quando la produzione della molecola desiderata viene effettuata, ad esempio, in un procariote. Pertanto si guarda ad essi come sistemi efficienti in diverse aree: correzione genica, produzione di proteine dalle proprietà farmacologiche e produzione di animali transgenici.

Nel costruire un MAC/HAC che sia perfettamente funzionale è necessario tener conto che i centromeri di mammifero, al contrario di quelli di lievito ed altri organismi inferiori, sono composti da sequenze di DNA altamente ripetute “in tandem” e rappresentano la maggior componenente dei centromeri umani. In ciascuna specie animale si trovano diverse famiglie di satelliti e diversi tipi di sequenze ripetute a livello dei centromeri. La famiglia maggiormente rappresentata nel DNA centromerico è quella del satellite alfa array, detto anche alfoide, ritrovata in tutti i centromeri umani.

L’interesse rivolto all’array (“sequenza”) di DNA alfa-satellite deriva dalla sua capacità di formare de novo cromosomi artificiali umani, ossia se ne ribadisce la sua essenzialità nell’ottenimento di un MAC/HAC.

Per la costruzione di HAC vengono seguiti più approcci, uno dei quali conduce alla formazione di cromosomi chiamati “HAC de novo”, i quali possono essere inseriti in linee cellulari umane mediante particolari microcellule (MMTT: Microcell Mediated Chromosome Transfer). L’HAC mima il normale pattern di espressione genica in quanto portatore del locus genetico completo, inclusi gli elementi regolatori. La loro esistenza in stato episomico evita complicazione come silenziamento transgenico ed eventi oncogenici da integrazione in siti indesiderati.

Per concludere,  MAC e HAC, pur assumendo una notevole importanza per la ricerca di base poiché costituiscono un sistema per lo studio e la caratterizzazione degli  elementi strutturali dei cromosomi, rappresentano, almeno concettualmente, il miglior vettore di espressione per cellule di mammifero e probabilmente anche per l’uomo. Infatti, i motivi per cui questi cromosomi artificiali potrebbero essere considerati vettori di trasferimento genico ideali sono fondamentali, come il comportarsi funzionalmente al pari di un qualsiasi cromosoma di mammifero (e pertanto sarebbe stabile con 1-2 copie per cellula senza integrarsi nel genoma), il non suscitare reazioni immunitarie indesiderate e contenere sequenze di DNA abbastanza grandi per una piena e controllata espressione dei geni terapeutici. Ed è quanto è stato osservato in esperimenti condotti su cellule staminali di topo impiegando cromosomi HAC veicolanti il gene, difettoso, della proteina distrofina come approccio per la cura della distrofia muscolare di Duchenne: il gene che codifica per la proteina distrofina  infatti possiede ampie dimensioni (2,4 Mb) e gli autori riferiscono assenza di integrazione nel genoma ospite, estrema stabilità e corretta espressione tessuto-specifica (H. Hoshiya et al., “A highly stable and nonintegrated human artificial chromosome (HAC) containing the 2.4 Mb entire human dystrophin gene, Mol. Ther., 2009).

Da quanto finora emerge, è chiaro che analisi più approfondite circa tipo di vettori impiegati, loro caratteristiche di invasività e immunogenicità, selettività del bersaglio cellulare, modalità di somministrazione e stabilità degli effetti nel tempo, costituiscono i punti chiave che necessitano di essere affrontati a fondo per garantire il buon esito, e soprattutto la sicurezza, di strategie terapeutiche che trovano il loro fondamento

nell’ingegneria genetica.

 

 

 

 

 

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2 Commenti
  1. Maria Smith

    Thank you for the article.

    Great blog that I enjoyed reading.

  2. Arianna Davis dice

    Dio benedica il dottor Abai per il suo meraviglioso lavoro nella mia vita, mi è stato diagnosticato HIV dal 2013 e stavo prendendo il mio farmaco ARV, non ero soddisfatto che avessi bisogno di ottenere l’HIV dal mio sistema corporeo, ho cercato una possibile cura per HIV Ho visto un commento su come l’HIV è curata con medicinali a base di erbe, ho contattato lui e mi ha guidato. Ho chiesto soluzioni, il rimedio per la mia salute è iniziato, mi ha mandato la medicina a base di erbe attraverso corriere. Ho preso farmaci prescritto per lui e 10 giorni dopo sono stato curato di HIV, il dottor Abai vero che sono un grande uomo, ha bisogno anche del tuo aiuto? Visita il suo sito web: https://drabaiherbalcure.webs.com contattarlo attraverso il suo WHATS- APP NUMERO +2348156769001, oppure contattarlo via email: drabaiherbalcure@yahoo.com

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